Ορολογικές δοκιμασίες για τη διάγνωση της λοίμωξης από τον ιό SARS-CoV-2 (λοίμωξη COVID-19)

Συγγραφέας

Σωτήρης Αβράμης

Χημικός Μηχανικός Ε.Μ.Π. , Athens MBA

 

Εισαγωγή

Οι ταχείες ορολογικές δοκιμασίες (rapid tests) για τη διάγνωση της λοίμωξης από τον ιό SARS-CoV-2 (λοίμωξη COVID-19) είναι σε αυξημένη ζήτηση προκειμένου να προσδιοριστεί καλύτερα ο αριθμός των κρουσμάτων, συμπεριλαμβανομένων των ασυμπτωματικών ασθενών ή όσων έχουν αναρρώσει. 

Οι ταχείες ορολογικές δοκιμασίες είναι εξετάσεις αίματος, που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να προσδιορίσουν εάν οι άνθρωποι έχουν εκτεθεί σε ένα συγκεκριμένο παθογόνο εξετάζοντας την ανοσολογική τους απόκριση. Αντίθετα, οι μοριακές δοκιμασίες RT-PCR που χρησιμοποιούνται επί του παρόντος σε παγκόσμιο επίπεδο ως το gold standard για τη διάγνωση κρουσμάτων περιπτώσεων COVID-19 μπορούν μεν να βοηθήσουν στη διάγνωση της “ενεργού λοίμωξης” (με ή χωρίς συμπτώματα), δεν θα δώσουν όμως πληροφορίες για το αν ένα άτομο μολύνθηκε και στη συνέχεια ανάρρωσε στο παρελθόν. 

Οι εξετάσεις RT-PCR απαιτούν τη λήψη ρινοφαρυγγικού ή στοματοφαρυγγικού δείγματος και μπορούν επίσης να είναι πολύ χρήσιμες για λόγους επιδημιολογικής παρατήρησης, αλλά αρκετά από αυτά τα rapid tests, όπως εξελίσσονται, βελτιώνουν και την διαγνωστική τους αξία και προσεγγίζουν τις μεθόδους αναφοράς (RT-PCR), με πολύ μικρότερο κόστος και γρήγορα αποτελέσματα. Ειδικά σε περιπτώσεις έξαρσης των κρουσμάτων, όπου τα εργαστήρια μοριακού ελέγχου φθάνουν στα όρια της δυναμικότητάς τους, αποτελούν μια σημαντική εναλλακτική λύση.

 

Χαρακτηριστικά σε μελέτη μιας από τις διαθέσιμες στην Ελλάδα ταχείας ορολογικής δοκιμασίας, δεδομένα της οποίας παρουσιάστηκαν πρόσφατα με βάση  ικανό αριθμό δειγμάτων (>100) από κρούσματα επιβεβαιωμένα με PCR, φάνηκαν εξαιρετικά αποτελέσματα συγκρίσιμα με αυτά των μοριακών μεθόδων. Ειδικά σε ασυμπτωματικούς ασθενείς, τα αποτελέσματα μπορεί και να υπερτερούν και να αποτελέσουν ένα σημαντικό εργαλείο όταν κάποιος θέλει να διερευνήσει τις επαφές ύποπτου για COVID-19 κρούσματος.

Σύμφωνα με ιατρό του ΕΟΔΥ:» Η εφαρμογή των γρήγορων τεστ στα σχολεία και γενικά σε χώρους όπου υπάρχει κίνδυνος θα βοηθήσει να έχει κανείς αποτελέσματα πολύ γρήγορα όποτε θα μπορεί να γίνει λήψη αποφάσεων σε πραγματικό χρόνο. Θα μπορούμε να προσδιορίζουμε τα κρούσματα τα οποία είναι ασυμπτωματικά, ώστε να προχωράμε σε περιορισμό και ιχνηλάτησή τους». Τέλος μπορούν να χρησιμοποιηθούν συνδυαστικά με PCR, για να ελαχιστοποιηθεί η πιθανότητα σφάλματος, αλλά και για λόγους επιδημιολογικής παρατήρησης ή μέτρηση της ανοσίας σε έναν πληθυσμό.

 

Ι. Περιγραφή των ορολογικών  δοκιμασιών

1.Ταχεία διαγνωστική δοκιμασία (Rapid DiagnosticTesting, RDT): 

Πρόκειται συνήθως για ποιοτική (θετική ή αρνητική) ανάλυση πλευρικής ροής που είναι μικρή, φορητή και μπορεί να χρησιμοποιηθεί στο σημείο φροντίδας (Point Of Care, POC). Αυτές οι εξετάσεις μπορεί να χρησιμοποιούν δείγματα αίματος από τσίμπημα δακτύλου, δείγματα σιέλου ή υγρά ρινικού επιχρίσματος. Τα RDT είναι συχνά παρόμοια με τα τεστ εγκυμοσύνης, καθώς  δείχνουν στον χρήστη χρωματιστές γραμμές για να επιβεβαιώσουν θετικά ή αρνητικά αποτελέσματα. Στο πλαίσιο της λοίμωξης COVID-19, αυτές οι δοκιμές ανιχνεύουν συχνότερα αντισώματα ασθενών (IgG και IgM) ή ιικό αντιγόνο. Σε κάποιες περιπτώσεις, μπορεί να είναι χρήσιμη η εξέταση για αντισώματα έναντι του ιού πριν την πιθανή έκθεση.

2.Ανάλυση ανοσοπροσροφητικού συνδεδεμένου με ένζυμο (ELISA): Αυτή η δοκιμή μπορεί να είναι ποιοτική ή ποσοτική και γενικά είναι μια εργαστηριακή δοκιμή. Αυτές οι εξετάσεις συνήθως χρησιμοποιούν δείγματα ολικού αίματος, πλάσματος ή ορού από ασθενείς. Το τεστ βασίζεται σε μια πλάκα που είναι επικαλυμμένη με μια ιική πρωτεΐνη που ενδιαφέρει, όπως η πρωτεΐνη-ακίδα (Spike). Τα δείγματα ασθενούς στη συνέχεια επωάζονται με την πρωτεΐνη και εάν ο ασθενής έχει αντισώματα έναντι της ιικής πρωτεΐνης, αυτά συνδέονται μεταξύ τους. Το δεσμευμένο σύμπλοκο αντισώματος-πρωτεΐνης μπορεί στη συνέχεια να ανιχνευθεί με μια άλλη έκπλυση αντισωμάτων που παράγουν ένδειξη χρώματος ή φθορισμού. Στο πλαίσιο του COVID-19, αυτές οι δοκιμές εξετάζουν συχνότερα αντισώματα ασθενών (IgG και IgM).

3.Δοκιμασίες εξουδετέρωσης: Αυτή η δοκιμή βασίζεται στο ότι η ύπαρξη αντισωμάτων στο δείγμα του ασθενούς θα αποτρέψει την ιογενή λοίμωξη κυττάρων στο εργαστήριο. Οι δοκιμασίες εξουδετέρωσης μπορούν να δώσουν σημαντικές πληροφορίες για το αν  ένας ασθενής έχει αντισώματα που είναι ενεργά και αποτελεσματικά έναντι του ιού, ακόμη και αν η λοίμωξη έχει ήδη υποχωρήσει. Αυτές οι εξετάσεις απαιτούν δείγματα ολικού αίματος, ορού ή πλάσματος από τον ασθενή. Διενεργούνται δε σε κυτταρική καλλιέργεια, μια εργαστηριακή μέθοδο καλλιέργειας κυττάρων που επιτρέπει την ανάπτυξη και πολλαπλασιασμό του ιού SARS-CoV-2 (όπως τα κύτταρα VeroE6). Όταν ο ιός και τα κύτταρα αναπτύσσονται με παρουσία σταδιακά μειούμενων συγκεντρώσεων αντισωμάτων ασθενών, οι ερευνητές μπορούν να οπτικοποιήσουν και να ποσοτικοποιήσουν την ικανότητα των αντισωμάτων στον ορό του ασθενούς να εμποδίσουν τον πολλαπλασιασμό του ιού. Αυτή η δράση αποκλεισμού μπορεί να συμβεί για παράδειγμα μέσω της σύνδεσης του αντισώματος σε μια σημαντική πρωτεΐνη εισόδου του ιού στα κύτταρα.

4.Ανοσοδοκιμασία χημειοφωταύγειας: Αυτή η δοκιμή είναι συνήθως ποσοτική, βασίζεται σε εργαστήριο και χρησιμοποιεί δείγματα ολικού αίματος, πλάσματος ή ορού από ασθενείς. Μια παραλλαγή αυτού του τεστ μπορεί να χρησιμοποιήσει μαγνητικά, επικαλυμμένα με πρωτεΐνη μικροσωματίδια και είναι γνωστή ως ανοσοδοκιμή  χημειοφωταύγειας με μικροσωματίδια. Το τεστ βασίζεται στην ανάμιξη δειγμάτων ασθενών με μια γνωστή ιική πρωτεΐνη, ρυθμιστικά αντιδραστήρια και συγκεκριμένα ενζυματικά επισημασμένα αντισώματα που επιτρέπουν μια φωτεινή, φωτεινή ανάγνωση. Τυχόν αντισώματα στο δείγμα ασθενούς που αντιδρούν στην ιική πρωτεΐνη θα σχηματίσουν ένα σύμπλοκο. Στη συνέχεια, προστίθενται σημασμένα αντισώματα που συνδέονται με αυτά τα σύμπλοκα. Αυτή η δέσμευση προκαλεί μια χημική αντίδραση που παράγει φως. Η ποσότητα φωτός (ακτινοβολία) που εκπέμπεται από κάθε δείγμα στη συνέχεια χρησιμοποιείται για τον υπολογισμό του αριθμού των αντισωμάτων που υπάρχουν σε ένα δείγμα ασθενούς. Μπορεί να εντοπιστούν αντισώματα IgG, IgM, IgA. Αυτή η δοκιμή μπορεί να αναζητήσει πολλούς τύπους αντισωμάτων και να χρησιμοποιηθεί για καθορισμό της εμβολιαστικής στρατηγικής.

Στον Πίνακα Α και τις εικόνες 1,2,3,4 περιέχονται περισσότερες λεπτομέρειες για τις διάφορες ορολογικές δοκιμασίες.

Στους Πίνακες 1,2,3 περιέχονται πρακτικές πληροφορίες για τα διαθέσιμες ταχείες ορολογικές δοκιμασίες στην Ελλάδα αυτή τη στιγμή

Πίνακας Α.

Τύπος δοκιμής	Ώρα για αποτελέσματα	Αυτό που μας λέει	Τι δεν μπορεί να μας πει	Εικόνα
Ταχεία διαγνωστική δοκιμή (RDT)	10-30 λεπτά	Η παρουσία ή απουσία (ποιοτικών) αντισωμάτων κατά του ιού που υπάρχει στον ορό του ασθενούς.	Συνήθως δεν κάνουν ποσοτική μέτρηση	Εικόνα 1
Ενζυμική ανοσοπροσροφητική δοκιμασία (ELISA)	2-5 ώρες	Η παρουσία ή απουσία αντισωμάτων κατά του ιού που υπάρχει στον ορό του ασθενούς.	Εάν τα αντισώματα είναι ικανά να αναστέλλουν την ανάπτυξη του ιού.	Εικόνα 2
Δοκιμασία εξουδετέρωσης (PNRT)	3-5 ημέρες	Η παρουσία δραστικών αντισωμάτων στον ορό του ασθενούς ικανών να αναστέλλουν την ανάπτυξη ιού ex vivo , σε ένα σύστημα κυτταρικής καλλιέργειας.	Μπορεί να χάσει αντισώ-ματα έναντι ιικών πρωτεϊ-νών που δεν εμπλέκονται στην αντιγραφή.	Εικόνα 3
Ανοσοδοκιμασία χημειοφωταύγειας (CLIA)	1-2 ώρες	Η παρουσία ή απουσία (ποσοτικών) αντισωμάτων κατά του ιού που υπάρχει στον ορό του ασθενούς.	Εάν τα αντισώματα είναι ικανά να αναστέλλουν την ανάπτυξη του ιού.	Eικόνα 4

 

Σημείωση:  Οι χρόνοι που αναφέρονται στις εργαστηριακές μεθόδους ποικίλουν από εργαστήριο σε εργαστήριο, και πολλές φορές είναι μεγαλύτεροι λόγω του φόρτου εργασίας, μια και πολλές φορές προηγούνται πολλά δείγματα προς ανάλυση

 

Εικόνα 1 : RDT τεστ

Τα αντισώματα απορροφώνται και μεταφέρονται στην ταινία που δίνει το αποτέλεσμα, καθώς συνδέονται με τμήματα του αντιγόνου.

 

 

 

Εικόνα 2: Μέθοδος ELISA

 

 

Eικόνα 3: PNRT Mέθοδος

Ζωντανός ιός προστίθεται σε διαφορετικές συγκεντρώσεις ορού του ασθενούς και ακολουθεί κυτταρική καλλιέργεια

 

Eικόνα 4: CLIA Methodology

 

 

Πίνακας Ι. Ενδεικτικά διαθέσιμα γρήγορα τεστ αντιγόνων στην Ελλάδα τον Οκτώβριο 2020

ΤΕΣΤ	Τύπος τεστ Μέθοδος	Ευαισθησία	Ειδικότητα	Άδεια	Ελληνικά Δεδομένα	ΤΙΜΗ
Genbody	Ανοσοχρωματικό	93	100	ΕΟΦ	NAI	320€ / 25 test
Nadal	Ανοσοχρωματικό	--	--	ΕΟΦ	__	200€ / 20 test
Wiiz ΒiotechAg	Ανοσοχρωματικό	93	100	ΕΟΦ	OXI	318 €/ 25 test
Innovita	Ανοσοχρωματικό	87,3	100	ΕΟΦ	NAI	500 € / 40 test

 

 

 

ΙΙ. Ενδεικτικά διαθέσιμα γρήγορα τέστ αντισωμάτων στην Ελλάδα τον Οκτώβριο 2020

ΤΕΣΤ	Τύπος τεστ Μέθοδος	Ευαισθησία	Ειδικότητα	Άδεια	Ελληνικά Δεδομένα	ΤΙΜΗ
Genbody	Ανοσοχρωμικό IgG/IgM	93	100	ΕΟΦ	NAI	320€/20 test
Ams Prestige	Ανοσοχρωμικό	--	--	ΕΟΦ	--	35€/ 2 τεστ Pharmacy4u
Nadal	Aνοσοχρωμικο IgG/IgM	94,1	99,2	FDA	--	245€/10 test
Wiz biotech	Aνοσοχρωμικο IgG/IgM	92,08	97.9	MHRA ΕΟΦ	--	318€/25test, 20/1 test

 

 

ΤΕΣΤ	Τύπος τεστ Μέθοδος	Ευαισθησία	Ειδικότητα	Άδεια	Ελληνικά Δεδομένα	ΤΙΜΗ
Genbody	Ανοσοχρωμικό	--	--	ΕΟΦ	ΟΧΙ	596 € / 25 test

 

 

 

 

 

Επιστροφή στην αρχική σελίδα -Πίνακα -Περιεχομένων
Σύνδεσμος :  Διαδικτυακό βιβλίο: Ο Κορονoϊός (SARS-CoV2) και η προκαλούμενη νόσος COVID-19

Βιβλιογραφία

1.    Developing a National Strategy for Serology (Antibody Testing) in the United States, John Hopkins Blueberg School of Public Health, 22^nd April 2020, https://www.centerforhealthsecurity.org/resources/COVID-19/serology/Serology-based-tests-for-COVID-19.html

2.    Μελέτη Ανοσολογικής απόκρισης SARS-CoV-2 σε προτυποποιημένο ορολογικό πάνελ, ομιλία Άγγ. Χατζάκη, 8η Πανελλήνια Συνάντηση AIDS & Ηπατίτιδες, Αθήνα, 26 Σεπτεμβρίου 2020

3.    Rapid Tests for Influenza, Respiratory Syncytial Virus, and Other Respiratory Viruses: A Systematic Review and Meta-analysis, AndreaH.L.Bruning et al, CID 2017:65 (15 September)

4.    Rapid Molecular Tests for Influenza, Respiratory Syncytial Virus, and Other Respiratory Viruses: A Systematic Review of Diagnostic Accuracy and Clinical Impact Studies, Laura M. Vos et al, CID 2019:69 (1 October) ,1243-53